안녕하세요. 국가마우스표현형분석사업단에서 마우스 제작을 담당하고 있는
고려대학교 의과대학의 김경미입니다. 저희 연구실은 크리스퍼 시스템 기반의 유전자 편집 기술을
고도화하여 이를 활용한 동물모델 제작 및 치료제 개발을 위한 적용 연구를 진행하고 있습니다.
오늘은 그 중에서도 마우스 모델 제작에 적용했던 유전자 편집 기술들에 대해 소개하고자 합니다.

크리스퍼 시스템 기반의 유전자 편집 기술

원핵 생물의 후천성 면역 시스템에서 파생 된 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템은 다양한 연구에 적용될 수 있는 혁신적인 게놈 편집 기술입니다. 이 중 3 세대 유전자 편집 시스템인 Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)는 가이드 RNA (gRNA)에 의존하여 게놈 상의 원하는 표적 위치에 돌연변이를 효율적으로 도입할 수 있습니다. Protospacer-adjacent motif (PAM) 서열이라 불리는 SpCas9의 표적 인식 서열은 5'-NGG-3'(N = A 또는 T 또는 G 또는 C) 입니다. 편집 및 보정을 위해 특정 유전자를 표적화 할 수 있는 Cas9 단백질은 짧은 gRNA에 상보적인 20 염기 쌍의 표적서열 위치에서 DNA 이중 가닥 절단을 생성합니다. 절단된 DNA는 비상동성말단접합 (NHEJ) 또는 상동재조합 (HDR) 메커니즘에 의해 복구되는 과정에서 삽입 또는 결실 (indel)의 돌연변이를 생성하게 됩니다. SpCas9은 매우 효율적이고 특성화 된 PAM 서열을 제공하기 때문에 동물 모델 제작 및 생체 내 연구를 포함한 다양한 기본 연구와 임상 응용 분야에서 널리 사용 할 수 있습니다.

다른 고효율 생체 내 유전자 편집 도구로는 Acidaminococcus sp. Cpf1 (AsCpf1)과 Lachnospiraceae bacterium Cpf1 (LbCpf1)이 보고되어 있습니다. Cpf1은 Cas9과 같이 표적 DNA의 이중 가닥 절단을 생성하여 수리 과정에 의해 염기 일부가 결실되거나 삽입 (Insertions and deletions, Indels)되는 돌연변이를 유도 할 수 있습니다. 또한, 다른 유전자 편집 방법에 비해 상동재조합 효율이 높기 때문에 특정 서열의 삽입 또는 전환이 가능합니다. 따라서 Cpf1은 절단에 의한 유전자변이 뿐만 아니라 녹인 (Knockin) 동물 모델 제작에도 유용하게 사용 될 수 있습니다. 저는 마우스 모델을 제작하는 연구에 Cpf1을 처음 적용하였고, 표적 유전자인 Tyrosinase gene이 높은 효율로 변이가 도입되는 것을 확인 할 수 있었습니다. 동시에 Tyrosinase 유전자의 녹아웃 (Knockout) 표현형인 백색증 (Albinism)을 보이는 것을 확인 할 수 있었습니다. 이처럼 Cpf1은 마우스모델 제작에 높은 효율로 적용이 가능한 유전자 편집 방법입니다.

최근에는 염기교정방법 (Base-editior, BE)이라 불리우는 단일 염기 수준에서의 전환이 가능한 새로운 유전자 편집 방법이 보고되기도 하였습니다. CRISPR 시스템의 개발로 원하는 표적 부위에 변이 유도가 수월해 졌음에도 불구하고, 특정 염기 수준의 치환은 상동재조합 수리 과정을 거쳐야하기 때문에 효율은 매우 낮습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 개발된 염기교정방법 (Base-editior, BE)은 주형이 되는 donor DNA 없이도 높은 효율로 단일 염기 수준에서의 변이를 유도 할 수 있습니다. 염기편집 방법에는 nickaseCas9(nCas9)과 cytidine deaminase로 구성된 cytosine base editing (CBE), nCas9과 변형된 adenine deaminase로 구성된 adenine base editing (ABE)가 보고되어 있습니다. CBE는 C에서 T로의 염기 치환이 가능하고, ABE는 A에서 G로의 염기 치환이 가능한 유전자 편집 방법으로 인간의 질환을 유도하는 다양한 유전체 변이 중 약 50%가 점 돌연변이인데 이것을 치료하기 위한 연구 및 동물 모델 제작에 적용 가능한 획기적인 방법입니다.

저희는 염기교정 방법인 CBE를 사용하여 C에서 T로 전환하여 Stop codon이 형성되도록 디자인하여 유전질환인 Dystrophin 유전자를 표적으로 처음으로 마우스 질환모델을 제작하였습니다. 또한,  ABE를 이용해서 A에서 G로 염기 전환을 통해 정상으로 교정되도록 치료연구에 적용하였습니다.

이처럼 다양한 적용이 가능한 크리스퍼 시스템 기반의 유전자 편집 기술은 연구 및 임상 적용을 위한 동물 모델 연구에 매우 중요한 위치에 있습니다. 저희는 지속적인 연구를 통해 유전자 편집 기술을 고도화 하여 마우스 모델 제작 연구에 기여하도록 더욱 더 노력하도록 하겠습니다. 감사합니다.

고려대학교 의과대학

김경미 교수

생명과학 이슈

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