연세대학교 의과대학

남기택 _ 교수

코로나바이러스감염증-19 (COVID-19)이란?

코로나바이러스감염증-19 (이하 COVID-19)는 2019년 12월, 중국 후베이성 우한에서 처음 발생하였으며, 현재는 전 세계적으로 확산된 호흡기 감염 질환입니다. 발생 초기에는 명확한 원인과 전파경로가 밝혀지지 않은 호흡기 전염병으로 알려졌으나, 2020년 1월 9일 세계보건기구 (이하 WHO)가 새로운 유형의 코로나바이러스 (SARS-CoV-2, 국제바이러스분류위원회 ’20.02.11 명명)에 의한 감염으로 규명하였습니다. 중국, 아시아 전역을 넘어서 전 세계에 COVID-19 확진자가 속출함에 따라, WHO는 1968년 홍콩독감, 2009년 신종플루에 이어 사상 세번째로 세계적 대유행을 선포하였습니다 (2020.3.11).

SARS-CoV-2 감염 경로는 비말, 접촉을 통해 전파된다고 알려져 있고 감염에 따른 주요 증상으로 발열, 기침, 호흡곤란 및 폐렴 경증에서 중증까지 다양한 호흡기감염 증상이 나타납니다. 국내에서는 2020년 1월 20일 COVID-19의 첫 감염사례가 발표되었으며, 2020년 11월 24일 기준, 누적 확진환자는 31,353명에 달하고, 사망환자는 496명에 이르며, 치명률 (사망자수/확진자수 x100)은 남성 1.82%, 여성 1.48%에 달합니다. (그림 1)

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그림 1. COVID-19 국내 누적 확진자 현황(11.27.00시 기준)

외국의 경우 유병률과 치명률이 국내에 비해 월등하게 높은 상황으로, 최근 미국의 경우 일 확진 환자가 10만명을 넘기는 등 확산세가 지속되고 있습니다.

COVID-19 치료제 및 백신 개발 동향

COVID-19에 특이적인 치료법이나 감염 억제를 위해 사용할 수 있는 특이적인 항바이러스 치료제나 백신은 아직 개발되지 않는 상태입니다. 화이자, 모더나 등 다국적 대형 제약사에서 백신 개발소식이 들려오고 있긴 하지만 보급 및 효과를 논하기에는 아직 무리가 있다고 여겨집니다.

RNA 바이러스인 코로나 바이러스 특성상, 항원 다양성이 크고 변이가 빈번하게 일어나므로 새로운 백신 및 타겟 치료제 개발이 쉽지 않은 것이 현실입니다. 또한 COVID-19는 확산이 빠른 특성을 가지고 있으므로, 전 세계적 COVID-19 치료제 관련 임상연구의 대표적인 특징은, 기존에 허가받은 치료제 또는 안정성이 담보되면서 효능이 충분히 입증되지 않은 신약후보물질을 다시 검토해 COVID-19 치료에 사용할 수 있는지에 대한 연구 (신약재창출, drug re-positioning) 방향으로 수행 중에 있습니다.

COVID-19 확진자 및 사망자의 세계적인 증가추세에 발맞추어 백신후보물질, 치료후보물질의 임상시험이 긴급승인되고 있긴 하나, COVID-19 전임상 연구를 통해 검증이 필요한 치료 및 백신의 효능, 약물 농도, 부작용사례 등이 매우 부족한 것이 사실입니다. 따라서, COVID-19 백신 및 치료후보물질의 임상시험뿐만 아니라, 유효성 및 안전성을 검증하기 위한 전임상 동물실험이 반드시 필요 합니다.

SARS -CoV-2 감염 동물 모델

COVID-19의 대유행으로 SARS-CoV-2 감염동물 모델이 빠르게 개발되고 있으며, 이 단계에서의 가장 큰 관건은 인간과 유사한 바이러스 반응 및 약물 반응을 보이는 동물모델을 만들어야 하는 것입니다. 이를 위하여, 우선 동물이 SARS-CoV-2에 감염되어야 하며, 감염 뒤 사람과 비슷한 감염 증상을 보여야 하는 것이 필수적입니다. 실험 동물 중 페럿과 고양이는 SARS-CoV-2 감염에 민감하다고 알려져 있으며, 반면 개, 돼지, 닭, 오리는 SARS-CoV-2 감염에 대한 민감도가 상대적으로 낮아 감염 및 전파력이 떨어지는 것으로 보고되고 있습니다.

SARS-CoV-2 바이러스는 사람의 심장과 콩팥, 위장점막 또는 폐에 많이 발현하는 엔지오텐신 전환효소 (human angiotensin converting enzyme 2 (hACE2), 이하 hACE2)와 결합하여 체내로 유입됩니다 (그림 2).

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그림 2. SARS-CoV-2 바이러스 타겟 수용체

여러 가지 장점 때문에 실험동물로 가장 많이 연구되고 활용되는 마우스는 ACE2 단백질이 사람과 차이를 보이기 때문에 COVID-19 연구를 위하여 hACE2 단백질을 발현하는 마우스를 만들어야 합니다. K18 프로모터 특이적 hACE2를 발현하는 형질전환 마우스 모델 (K18-hACE2 Tg)이 2007년 개발되어 있으며, 해당 모델을 이용하여 SARS-CoV-2 감염에 관한 전임상 연구들이 진행 중입니다. hACE2 발현 마우스 모델은 SARS-CoV-2의 감염, 그에 따른 체중감소 및 폐 병변, 면역반응 등의 특성이 사람과 매우 유사하다는 점에서 전임상 연구에 적합합니다 (그림 3).

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그림 3. 사람과 hACE2 마우스 모델의 SARS-CoV-2 감염 특성 비교

SARS -CoV-2 감염 전임상 실험 및 병리 분석

SARS-CoV-2 감염 시설 및 출입

SARS-CoV-2와 같은 고위험성, 감염성 미생물은 생물안전 3등급 연구시설 (BSL-3 laboratory)에서 실험이 이루어 집니다. BSL-3는 취급생물체 및 생물재해로부터 실험자 및 피실험자의 안정성 확보를 위한 시설입니다. 해당 시설은 사전에 허가를 받은 실험자에 한하여 출입이 가능하며, 실내 위험균의 외부 유출 방지를 위해 항상 공기흐름이 BSL-3쪽으로 향하게 차압이 걸려있습니다.

출입 시에는 규정에 맞는 복장 및 개인 호흡 장비를 갖추어야 합니다 (그림4).

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그림 4. BSL-3 시설 출입 시 보호복 착용 절차

마우스 모델의 SARS-CoV-2 감염 및 모니터링

SARS-CoV-2 바이러스는 K18-hACE2 Tg 마우스 마취 후, 비강에 직접 접종하여 감염을 유도합니다 (그림5).

감염 후에는 1일 1회 이상 마우스의 상태, 행동분석, 식이섭취, 체중, 체온 계측 등을 통하여 마우스 상태를 점검, 모니터링 합니다. 감염 전 대비, 마우스 체온 25℃ 이하, 체중 25% 이상 감소가 보이면 마우스는 안락사하여 부검을 진행합니다. 이러한 급격한 변화가 없을 시에는 정해진 감염 후 실험 일정(Dpi)에 따라 마우스 부검을 진행하게 됩니다.

치료제 전임상 실험의 경우, SARS-CoV-2 감염 이후 약물 기전에 따라 치료제 투여시기가 결정됩니다. 백신의 전임상 실험은 백신투여를 통해 immunization을 유도한 이후 SARS-CoV-2 감염을 진행하고 치료제의 경우 감염 후 일정에 따라 약물을 임상경로로 감염마우스에 투여합니다.

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그림 5. SARS-CoV-2 바이러스의 마우스 비강 접종

마우스 모델의 부검 및 조직 표본 제작

마우스의 안락사가 시행되면 RNA 분석을 위한 샘플, SARS-CoV-2 바이러스 역가 측정을 위한 샘플 및 조직병리학적 분석을 위한 샘플 등 다양한 목적에 맞도록 장기의 적출 및 조직의 분배가 이루어 집니다.

조직병리학적 분석을 위해서는 부검 즉시 고정액 처리 및 외부 노출 최소화를 위한 신속고정방법으로 shaking 을 수행 해야하며, 사용되는 고정액은 SARS-CoV-2 바이러스의 불활화를 위하여 10% 중성 포르말린을 사용합니다.

24시간 이상 고정 후, 명확한 조직병리 분석을 위하여 주변 조직을 덜어내고 원하는 조직단면만을 얻기 위한 조직 삭정 (trimming)을 수행합니다. 조직삭정은 장기 특성과 무게 등을 고려하여 카세트에 담아 포매 (embedding)를 진행합니다. 포매에는 파라핀이 사용되며 이를 이용한 조직보관 방법은 장기간 보관이 용이하고, 온도 및 습도에 큰 영향을 받지 않는다는 장점이 있습니다. 제작된 파라핀블록은 얇게 박절하여 슬라이드에 올린 뒤, Hematoxylin & Eosin으로 염색하고 이를 통해 조직의 구조를 관찰하고 분석합니다 (그림6).

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그림 6. SARS-CoV-2 감염 전 후 K18-hACE2 Tg 폐 조직병리 비교

조직병리는 폐장을 포함하여 관련된 장기를 조직병리전문가에 의해 판독되면 폐의 경우 염증의 성격 분포 등을 판독하고 기관지 및 폐포의 범위까지 판단하여 각 파라미터에 맞추어 스코어링(점수화)하여 정량적으로 평가하여 폐 병변을 확인합니다. K18-hACE2 Tg 모델은 SARS-coV-2 바이러스에 감수성을 가지고 있으며, 감염 시 나타나는 폐 병변을 확인할 수 있으므로 COVID-19 치료제 및 백신 개발 전임상 모델로 활용이 가능할 것으로 기대합니다.