Mouse Xenograft Model

가천대학교 약학대학 오승현

 

질병의 원인을 규명하고 치료법을 개발하는데 있어서 좋은 모델은 무엇일까에 대한 고민은 끊임없이 계속되고 있습니다. 역설적이게도 최근에는 인간과 가장 가까운 반려동물이 질환모델로 제시되고 있습니다 (그림1). 반려동물은 유전적으로 인간과 가깝고 여러 환경 요인을 공유한다는 점에서 선천적 유전자적 변화 이외에 여러 요인에 의해 발생하는 만성 질환 연구에 적합할 것입니다. 그러나 유전적 조작과 대량 사육이 용이하고, 짧은 생애 주기를 갖는 마우스가 아직은 많은 연구자들이 선호하는 동물 모델입니다.

 

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그림 1. 모델동물로서 반려동물

 

인간의 다양한 질환 중 암은 우리나라에서 사망원인 1위이며 지속적으로 사망자가 증가하고 있어 많은 연구자들의 주요 연구대상입니다. 암에 대한 마우스 모델은 역사적으로 산업혁명 이후로 독성물질이 암을 유발한다는 인과관계를 인지하여 다양한 화학물질을 이용한 암모델이 이용되다가, 1960년대 T면역세포가 결핍된 누드 마우스가 발견된 이후로 다양한 면역 결핍마우스를 이용한 이종이식 모델이 등장하게 되었습니다. 또한 유전공학 기법의 발달에 따라 특정 유전자의 과발현 또는 제거에 의한 암모델이 이용되고있습니다. 최근 주목 받고 있는 면역치료에 대한 모델로서는 제한이 있지만 신약개발과정 중의 스크리닝 및 효능 평가에서 여전히 사용되고 있고 일반 연구자에게서 가장 많이 사용되고 있는 xenograft 모델의 확립 및 사용에 있어서 그동안의 경험을 바탕으로 몇 가지 정보를 드리고자 합니다.

 

1. 세포주 선택

많은 학생들이 세포주 실험에 사용한 암세포를 동물에 이식하면 당연히 성장할 것으로 생각하지만 표 (그림 2, 누드 마우스를 사용한 종양형성 능력 평가, Anticancer Drug Development Guide, 2004)에서 보는 바와 같이 우리에게 익숙한 많은 세포주가 동물실험에 적절하지 않음이 검증되었습니다.

마우스에 이식하였을 때 세포주에 따라 종양이 전혀 형성되지 않기도 하고, 일부의 마우스에서만 종양이 형성되거나 또는 이식한 모든 마우스에서 100% 종양이 형성되기도 합니다.  세포주 실험 후 동물실험을 고려한다면 세포주 선택에서부터 주의해야 합니다. 필요한 경우 종양세포 이식 후 종양이 형성된 마우스만 선택하여 사용하는 경우도 있습니다.

 

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그림 2. 종양세포주의 이식 후 종양 형성능력 비교

 

2. 마우스 선택

면역결핍 마우스 중에서 가장 많이 사용되는 누드 마우스는 T세포만, SCID 마우스는 T세포와 B세포가 기능적으로 결핍되어 있으며, NOD/SCID 마우스는 단핵구가 비정상인 NOD 마우스와 SCID 마우스를 교배하여 좀 더 면역이 결핍되도록 확립된 마우스입니다 (그림 3). NOG 마우스와 NSG 마우스는 NOD SCID 마우스를 IL-2Rγnull 마우스와 교배하여 만들어진 마우스입니다. IL-2 수용체는 IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ로 구성되는데, 이 중에서도 IL-2Rγ는 IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21 등의 다른 사이토카인 수용체를 구성하는 데 필요합니다. 따라서 NK 세포 발생에 중요한 사이토카인 신호 전달도 억제되므로 이들 마우스에서는 NK세포 면역도 결핍되게 됩니다.

면역 결핍의 정도가 심한 마우스를 사용할 수록 종양 발생의 확률이 증가하고 종양의 성장 속도가 빨리질 가능성이 있습니다. 또한 많은 연구자들이 혼동하는 것 중에 중 하나가 BALB/c nude 와 athymic nude 마우스의 구별입니다. 두 계통 모두 FOXN1 유전자의 돌연변이에 의한 흉선의 발달이 저하되어 있고 이식거부 반응이 없다는 공통점이 있으나, 근교계와 폐쇄군이라는 차이가 있어 구별해서 사용해야 합니다.

 

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그림 3. 면역 결핍 마우스 종류와 면역계 구성 요소의 기능 유무

 

3. 세포주 주입

동물에 이식할 세포는 최상의 상태가 요구됩니다. 단순히 많은 숫자를 주입한다고 해서 종양의 발생 확률이 높아지고 성장속도가 빨라지는 것이 아니기 때문에 배양과정 중 FBS 품질, 배양시간을 최적으로 유지해야합니다. 세포주 오염은 이식 후 종양의 성장을 방해하거나 마우스 감염 또는 동물실 오염을 유발할 수 있으므로 미리 확인해야합니다. 배양 중인 세포를 떼어 내어 마우스 피하에 이식하는 과정에서도 최대한 신속하게 세포를 PBS에 농축하고 동물실로 이동하여 마우스에 이식해야 합니다 (그림 4).

또한 마우스의 수가 많을 경우 이식 중 시간이 지연되어 세포가 가라앉을 가능성이 있으므로 이식할 세포주를 잘 섞어야 하며 사용되는 마우스의 이식 부위가 동일해야 고른 성장을 예상할 수 있습니다. 이외 세포배양 조건, FBS 종류, 동물실 환경, 면역결핍마우스의 종류 등에 따라 종양의 형성 유무, 성장 속도 및 개체 차이 등이 나타납니다. 제일 바람직한 방법은 예비 실험을 통해 이러한 점을 미리 파악하여 실험 일정 및 실험군의 크기 등을 정하는 것입니다.

 

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그림 4. 마우스에서 종양세포 이식 과정

 

일반적으로 마우스 피하에 세포주를 이식하지만 목적에 따라 다른 부위를 선택할 수 있습니다. 암세포의 기원을 고려하여 폐암 세포주, 뇌암 세포주, 간암 세포주 등을 각각 마우스의 폐, 뇌, 간에 직접 이식하는 방법으로서 orthotopic 모델이라고합니다. 숙련된 기술이 요구되지만 피하 조직에 비해 종양 형성에 필요한 미세환경 (세포)가 조성되어 있어 종양형성이 잘 되거나 성장이 빨라지기도 하고 개체 차이가 적어지기도 합니다.

 

4. 효능 평가

종양이 성장하게 되면 주 1-2회 calipers를 사용하여 크기를 측정하거나 최종적으로 부검 시 종양을 적출하여 무게를 측정하여 비교할 수 있습니다 (그림 5). 경우에 따라 전이능력이 있는 세포는 다른 장기로 전이를 하는 경우도 있으므로 확인할 필요가 있습니다. 세포주를 마우스 피하가 아닌 장기에 직접 이식하는 경우, 육안으로 성장여부가 확인이 안되므로 luciferase 발현 세포주 등을 이용하는 바이오이미징 기법으로 마우스 체강 내부에서의 성장 및 전이를 확인할 수 있습니다.

 

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그림 5. 마우스 종양 크기 측정법

 

5. 종료시점

실험 과정 중 종양의 크기 측정이 가능하므로 유의적인 차이가 확인되면 종료를 하게 됩니다. 하지만 예상된 결과에 도달하지 않았더라도 종양의 크기가 마우스 체중의 10-15%에 도달하게 되면 안락사를 권장합니다 (예, BALB/c nude 평균체중 20g 일 경우 종양의 크기가 종양 3,000mm3 = 3g 에 도달하면 마우스 체중의 15%를 초과하므로 안락사 권장). 무리한 실험 연장은 윤리적으로 문제가 되어 발표가 불가능한 결과를 생산할 수도 있기 때문입니다.

면역결핍 마우스를 이용한 xenograft 모델 사용은 암 연구에 있어서 다양한 암종에 대한 모델을 손쉽게 제작하고 종양의 크기 변화 관찰이 용이하며 빠른 시간 내에 실험을 완료할 수 있는 장점이 있습니다. 그러나 면역결핍 마우스는 감염에 취약하여 공조시설이 완벽히 갖춰진 곳에서만 실험 수행이 가능하고, 다른 장기로의 전이가 발생하기에는 너무 빠른 시간 내에 종양이 성장하며 종양의 미세환경(면역)에 대한 연구를 하기에는 한계가 있다는 단점이 있습니다. 그럼에도 불구하고 초급 연구, 약물 스크리닝에 있어서 아직까지 가장 많이 사용되고 있으나 모델 정립에 대한 구체적인 방법 소개가 제한적이어서 개인 연구자들이 시행착오를 겪고 있는 실정입니다. 기초적이고 간단한 내용이지만 유전자 기능 연구 및 신약의 효능 확인을 하시는 연구자들에게 도움이 되기를 바라며 성공적인 실험을 수행하여 마우스의 희생이 조금이나마 줄기를 바라는 마음으로 글을 마칩니다. 끝으로 오랜 시간 동안 동고동락하며 열심히 연구하는 실험실원들에게 감사의 말씀을 드립니다.

 

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그림 6. 동물실험 종료 시점