연구동향

제목 노령 마우스 및 인간의 사후 뇌에 적용 가능한 투명화 기술 개발
작성일 2015-10-23 조회수 1086
작성자 관리자

일본 이화학연구소(RIKEN)는 생체 조직을 항체나 색소로 염색하여 세포 구조를 보존하면서 투명화하는 신기술을 확립하였다. 이 기술을 이용하여 노령의 알츠하이머병 모델 마우스나 알츠하이머병 환자의 사후 뇌에서 일어나는 아밀로이드반을 다른 공간 해상도로 정량적으로 관찰하는 것이 가능하게 되었다. 

최근 형광단백질의 유전자 도입기술의 발달에 따라 샘플 표면의 깊이에 관계없이 생체구조를 형광표식할 수 있게 되었다. 형광표식한 구조를 높은 정밀도로 관찰할 때는, 조직의 절편을 형광 화상을 연속적으로 추출한 후 이를 겹쳐 올리는 방법을 사용한다. 이러한 기계적인 방법은 힘들 뿐만 아니라 3차원 재구축이 어렵다는 문제가 있다. 이에 연구진은 2011년 개발한 요소를 베이스로 생물 샘플을 투명하게 하는 시약 Scal/eA2를 이용하여 샘플에 상처를 입히지 않고 표면에서 수 밀리의 중심부를 고정밀도로 관찰하는 기술인 Scal/e를 개발하였다. 하지만 Sca/eA2를 사용한 투명화 기술은 처리 시간이 길어 조직이 팽윤한다는 문제점이 있었고, 연구진은 이에 요소 이외의 성분을 추가하는 것으로 문제를 해결하고자 하였다. 또한 연구진은 다른 투명화 기술과의 비교 검토를 통해 투명화하는 능력과 조직구조(형광 시그널)을 유지하는 능력 사이의 트레이드오프에 주목하여, 이 문제를 실용적으로 해결하고자 하였다. 그리고 투명화 기술과 함께 3차원 조직을 항체나 색소를 이용하여 형광 표식하는 기술을 개발하여 인간 조직에 응용하고자 하였다. 

연구진은 요소 소르비톨을 배합한 시약 Sca/eS를 제작하였다. 요소와 소르비톨의 상승효과를 통해 투명화 능력을 향상시키고, 유기용매 혹은 고농도의 계면 활성체를 첨가하는 것으로 형광 시그널의 소실 및 조직 구조의 파괴를 방지하고자 하였다. Sca/eS 기술을 마우스 성체 대뇌반구에 적용하면 수일간에 투명화되지만, 현저한 조직팽윤은 확인되지 않았다. ([그림 1]) 다음으로 2개의 날을 가진 면도칼을 이용하여 투명뇌 반구에서 슬라이드를 잘라내었다. ([그림 1 하]) 이 슬라이드는 직립할수록 굳고 튼튼하며, 잘라낸 면은 평탄하고 매끄러운 모양으로 투명뇌 트리밍을 매우 간단히 할 수 있다. 투명화한 마우스 뇌의 미세 구조를 전자 현미경으로 관찰하면, 광범위에 걸쳐 생체 막 연속성이 보존되며, 스냅스 구조가 쉽게 동정된다는 것을 확인하였다. 

연구진은 이전부터 Sca/e 기술을 이용하여 샘플이 생체 고분자를 떼어내기 쉽다는 점에 주목하였다. 이 현상을 이용하면 뇌 샘플의 내부 구조를 통채로 항체 및 색소에서 염색하는 방법인 `AbSca/e`나 `ChemSca/e`를 개발하였다. 이어 연구진은 Sca/eS에 AbScale이나 ChemScale을 조합시켜, 알츠하이머 병의 뇌 조직 병변을 관찰하였다. 관찰을 위해서는 인간 알츠하이머병 환자의 병리를 충실히 재현한 모델 마우스를 이용하였다. 이 모델 마우스의 뇌는 생후 약 40주령이 지나면 알츠하이머병의 발증에 관여되는 아밀로이드반이 다수 출현한다는 것을 확인하였다. 이를 통해 나이가 들면 마우스 뇌의 조직이 단단하게 되어 투명화가 어렵다는 사실을 알게 되었다. 실제로 종래의 투명화 기술의 검증 실험에는 대부분 약 10주령의 젊은 마우스의 뇌를 사용하였다. 연구진은 노령 마우스의 뇌의 투명화에 도전하였다. 36주 및 72주령의 모델 마우스의 대뇌반구를 대상으로 항아밀로이드 항체(녹색 형광 표식)를 사용한 AbSca/e법을 이용한 아밀로이드반을 국재적으로 조사하였다. 아밀로이드반은 36주령 샘플에서는 거의 검출되지 않았지만, 72주령 샘플에서는 피질층 거의 전체에 걸쳐 고밀도로 관찰됨을 확인하였다. ([그림 2]) 또한 샘플을 아밀로이드반 특이적으로 결합한 형광색소(PP-BTA-1)로 염색하여, 72주령 뇌의 대혈관을 따라 국재적으로 퍼지는 혈관염을 도출하였다. ([그림 2]) 

다음으로 아밀로이드반이 뇌 내의 면역반응을 담당하는 미세아교세포(microglia)와 어떻게 상호작용하는지를 조사하였다. 이를 위해 녹색형광표식과 함께 미세 아교세포를 특이적으로 염색한 항체(적색형광표식)를 이용한 2색 AbSca/e를 이용하였다. 3차원 공간의 물리적 거리를 계측한 프로그램을 작성하여, 미세 아교세포의 3차원에 걸친 거리의 근접도에 따라 각 아밀로이드반의 염증성을 평가하였다. ([그림 3]) 40~80주령의 마우스뇌를 사용한 실험 데이터를 비교 및 검토하여 가령에 따른 아밀로이드반의 총수가 확대되며 염증성 아밀로이드반 비율이 감소한다는 것을 확인하였다. 이번 해석은 질환 조기의 염증이 일어난다는 것을 시사하며 이를 통해 실험 데이터를 높은 재현성으로 모으는 것이 가능하게 되었다. 

투명화 기술을 이용하면, 거의 모든 뇌 레벨에서 아밀로이드반 분포를 조사하거나 세포 레벨에서의 아밀로이드반 및 미세아교세포의 상호작용을 조사하는 것이 가능하다. 하지만 질환 메커니즘을 해명하기 위해서는 보다 높은 공간능으로 아밀로이드를 줌인할 필요가 있다. 이에 AbSca/e에서 염색한 아밀로이드반 중 임의의 하나를 선택하여 뇌 샘플을 잘라 작은 블록을 만드는 방법으로 주민하여 아밀로이드반을 전자 현미경에서 관찰하였다. 이 시험은 투명화능력과 조직구조 유지능력을 모두 이루는 것이 가능하게 되었다. 또한 아밀로이드반 주위의 흥분성 시냅스를 관찰하는 것으로, 큰 데미지 없이 신경조직을 보존할 수 있다는 것을 확인하였다. 

한편 연구진은 이러한 해석을 인간 알츠하이머 환자의 사후뇌 샘플에도 적용하였다. 아밀로이드반과 같이 3차원적으로 복잡한 구조는 한 방향만 관찰해서는 전체 상으로 연결시킬 수가 없다. 투명 샘플의 강점은 기계로 자를 필요 없이 여러 각도에서 여러 두께의 광학적 슬라이드를 만들 수 있다는 것이다. 통항 2차원 화상이나 3차원 화상에서는 보이지 않는 구조를 가시화할 수 있다. 연구진은 60세 이상의 9명의 환자의 뇌 샘플에서 아밀로이드반과 미세아교세포를 녹색 및 적색의 형광 표식 항체로 염색한 결과 경계 분명료한 미만성 아밀로이드반을 효율적으로 검출할 수 있게 되었다. 일반적으로 미만성 아밀로이드반은 미염습성 구조체로 알려져있다. 하지만 미세아교세포와의 상호작용을 지표로 정량적인 해석을 수행하면, 미만성 아밀로이드반쪽이 일반 아밀로이드반(변화 아밀로이드반)보다 유의하게 높은 확률로 염증을 보이는 소견이 있다. 미만성 아밀로이드반이 아밀로이드반의 전구체라는 통설에 따라 위의 연구는 연구테마 질환 조기 특유의 염증 소견으로 설명할 수 있다. 

생체 조직의 투명화를 위해서는 여러 가지 기술 상 트레이드오프가 있다. 따라서 실험 목적에 따라 양질의 수법을 찾아내는 것이 불가결하다. 다른 투명화 기술을 동시에 비교시행하는 것이 중요하며 같은 샘플에서 복수의 기술을 시험하는 경우 Sca/eS와 같이 샘플에서의 데미지가 적게 미치는 경향이 유효하다. 

투명화에서 3차원 접근법이 주목받으면서, 절편을 이용한 종래의 2차원 접근법이 배제되는 것은 아니다. 2차원 어프로치와 3차원 어프로치, 또 광학현미경 관찰 및 전자현미경 관찰을 조합하는 것으로 관찰 대상을 자유 자재로 줌인 및 아웃하는 것이 가능하다. 신경회로의 망라적 해석 및 개별연구와 유연하게 연결할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 미만성 아밀로이드반과 같이 넓고 깊은 영역에서 복잡한 조직 구조를 차원적으로 가시화하는 기술을 발전시키면 향후 질병 메커니즘의 이해도를 높이고, 약제 평가 및 정밀도를 향상시키는데 매우 도움이 될 것이다. 

본 연구성과는 다음 논문에서 확인할 수 있다. 
Hiroshi Hama, Hiroyuki Hioki, Kana Namiki, Tetsushi Hoshida, Hiroshi Kurokawa, Fumiyoshi Ishidate, Takeshi Kaneko, Takumi Akagi, Takashi Saito, Takaomi Saido & Atsushi Miyawaki, "ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging", Nature Neuroscience, doi: 10.1038/nn.4107 

 

키워드 : 생체 이미징, 광학, 투명화

출처: 원문: http://www.riken.jp/pr/press/2015/20150915_1/

다음글
이전글